تصميم البروتين الرابط BindCraft2: كيف يتم توليد وتقييم الروابط الخاصة بالهدف؟

يُعد تصميم رابط بروتيني (protein binder) يتعرف على هدف واحد بتقارب عالٍ وخصوصية عالية حاجة أساسية في علم الأحياء والطب، والقيام بذلك انطلاقاً من بنية الهدف وحدها، دون جولات طويلة من التحسين التجريبي، من شأنه إزالة عائق رئيسي. يبقى تحديد المرشحين ذوي التقارب العالي عائقاً لأن تصميم الروابط يتطلب عادةً توليد وفرز آلاف التصاميم افتراضياً لاستخراج عدد قليل من النتائج الواعدة [5]. هذا يعني أن أي خط أنابيب يمكنه رفع نسبة التصاميم المُولّدة حاسوبياً التي تتبين لاحقاً أنها ترتبط فعلياً في المختبر له قيمة عملية مباشرة: عدد أقل من التصاميم يحتاج إلى تصنيع واختبار، مما يوفر الوقت وتكلفة الكواشف.

هناك عائلتان من الأساليب الحاسوبية تعالجان هذه المشكلة. الأساليب القائمة على البنية مثل RFDiffusion وAlphaProteo يمكنها توليد هياكل أساسية (backbones) للروابط مشروطة ببنية الهدف [5]. أما العائلة الأخرى، الأساليب القائمة على الهلوسة (hallucination-based)، فتقوم بتحسين بنية مباشرة داخل شبكة التنبؤ بالبنية بدلاً من أخذ عينات من نموذج بنية أساسية توليدي. BindCraft هو طريقة تصميم روابط قائمة على الهلوسة تستفيد من شبكة AlphaFold2 [5]. هذا التمييز مهم للمطوّر لأنه يحدد البرمجيات والأوزان المطلوبة: طريقة الهلوسة تحتاج إلى متنبئ بنية قابل للاشتقاق (differentiable) وحلقة تحسين قائمة على الانحدار التدريجي، بينما طريقة الانتشار (diffusion) للهيكل الأساسي تحتاج إلى نموذج انتشار مدرَّب بالإضافة إلى خطوة منفصلة لتصميم التسلسل.

مسألة مدى جودة هذه الروابط فعلياً بعد تصنيعها منفصلة عن كيفية عمل خط الأنابيب، والأدلة على هذه النقطة متفاوتة بين الأوراق البحثية. أفاد BindCraft بمعدلات نجاح تجريبية تتراوح من 10% إلى 100% [7]، وهو نطاق واسع يعتمد بشدة على فئة الهدف. تترابط درجات الثقة من نماذج التنبؤ بالبنية، وخاصةً ipTM (interface pTM) بين الواجهات، مع قوة الارتباط [5]، لكن ترابط مقاييس الثقة مثل pLDDT وipTM وipAE مع نتائج الارتباط التجريبية تم التحقق منه على مجموعات بيانات محدودة فقط ولا يزال مفهوماً بشكل ضعيف عبر الأهداف وأنظمة التصميم المختلفة [6]. لذا ينبغي للمطوّر ألا يتعامل مع أي رقم ثقة منفرد كدليل على الارتباط، بل كمرشح أظهر بعض الترابط في بعض السياقات فقط.

بسبب هذه الفجوة بين الثقة الحاسوبية والنتيجة المخبرية، أصبحت جهود وضع المعايير المرجعية (benchmarking) وتحسينات دوال التقييم مجالات عمل نشطة إلى جانب خطوط الأنابيب التوليدية نفسها. صُمم BindEnergyCraft خصيصاً لتقديم إشارة تحسين أكثر كثافة وإفادة من ipTM [5]، وصُمم ProtDBench خصيصاً لتقديم بروتوكول تقييم موحّد ومتعدد المُحقّقين (verifiers) لمقارنة الروابط المُولَّدة [6]. مجتمعةً، يمثل هذان المساران، أهداف تحسين أفضل ومعايير مرجعية أفضل، ما يحتاج المطوّر لفهمه قبل اتخاذ قرار بشأن خط الأنابيب ودالة التقييم المناسبين لهدف معين.

BindCraft هو خط أنابيب مفتوح المصدر وآلي لتصميم روابط بروتينية من الصفر (de novo) [7]. يستفيد من أوزان AlphaFold2 لتوليد روابط بروتينية انطلاقاً من بنى الأهداف [7]. هذا يعني أن المستخدم لا يدرّب نموذجاً جديداً: بدلاً من ذلك، يشغّل خط الأنابيب إجراء تحسين داخل رسم الحساب الموجود لـ AlphaFold2، معاملاً أجزاء من المدخل (تسلسل الرابط أو بنيته) كمتغيرات حرة وكل شيء آخر (بنية الهدف) كثابت.

طُبّق خط الأنابيب على نطاق واسع. طُبّق BindCraft على مستقبلات سطح الخلية، ومسببات الحساسية الشائعة، والبروتينات المصممة من الصفر، والنيوكليازات متعددة النطاقات مثل CRISPR-Cas9 [7]. في عدة تطبيقات من هذه، أظهرت الروابط المصممة تأثيرات وظيفية تتجاوز مجرد الارتباط. أُفيد بأن الروابط المصممة تقلل من ارتباط IgE بمسبب حساسية شجر البتولا، وتُعدّل نشاط التحرير الجيني لـ Cas9، وتقلل من السمية الخلوية لسم معوي بكتيري منقول بالغذاء، وتُعيد توجيه غلافات الفيروس الغدي المرافق (AAV) لتوصيل الجينات المستهدف [7]. في أحد العروض التوضيحية، ولّد BindCraft روابط بتقارب نانومولاري دون فرز عالي الإنتاجية أو تحسين تجريبي، بما في ذلك لأهداف بلا مواقع ارتباط معروفة [7].

اختبرت مجموعات مستقلة منذ ذلك الحين BindCraft على فئات أهداف محددة لمعرفة مدى صمود هذه الادعاءات خارج الورقة البحثية الأصلية. بالنسبة إلى MDM2، ولّد BindCraft 70 ببتيداً فريداً، وصُنّع منها 15، وأظهرت 7 ارتباطاً نوعياً بتقاربات نانومولارية [12]. أكّدت فحوصات المنافسة الارتباط الخاص بالموقع لببتيدات MDM2 عند موقع الهدف المقصود [12]، وهو تحقق مهم لأن الارتباط غير النوعي بالموقع لن يكون مفيداً لمعظم التطبيقات. بالنسبة إلى WDR5، ارتبط ستة من تسعة مرشحين بموقع WBM الرابط لـ MYC بتقارب دون-ميكرومولاري [12]، وحسّن التعديل الكيميائي العقلاني فعالية أحد روابط WDR5 بمقدار ستة أضعاف إلى KD يبلغ 39 نانومولار [12]. هذا يُظهر أن مخرجات BindCraft يمكن أن تكون نقطة انطلاق لمزيد من التحسين الكيميائي الطبي، وليست إجابة نهائية فقط. مع ذلك، لم يُظهر أيٌّ من الببتيدات المُولَّدة بواسطة BindCraft المختبَرة لـ PD-1 وPD-L1 ارتباطاً قابلاً للكشف [12]، وهذا مثال مضاد مباشر يُظهر أن النجاح يعتمد على الهدف وليس مضموناً. يمكن لـ BindCraft توليد ببتيدات عالية التقارب انطلاقاً فقط من بنية الهدف [12]، لكن نتيجة PD-1/PD-L1 تُظهر أن هذه القدرة لا تنتقل بشكل موحد إلى كل هدف.

على نطاق أوسع، يُدمج Human Bindome طريقة BindCraft المُختبَرة تجريبياً في إطار عمل مُسرّع ومتوازٍ مع اختيار آلي للأهداف على مستوى النطاق (domain-level) [13]. باستخدام هذا الإطار، تم توليد 306,146 مرشح رابط لـ 8,296 بروتيناً بشرياً، مما يغطي 40.9% من البروتيوم الكامل [13]. يتضمن كل مرشح في Human Bindome تسلسلاً محدداً، ونموذج بنية متوقع للرابط-الهدف، ومقاييس ثقة حاسوبية (in silico) [13]، مما يوفر للمطوّر نموذجاً لما ينبغي أن يحتويه سجل مرشح عند تشغيل خط أنابيب على نطاق واسع.

يُهلوس BindCraft بنى الروابط باستخدام AlphaFold2 ويُجري تحسيناً قائماً على التدرج (gradient) لدرجة TM المتوقعة للواجهة (ipTM)، إلى جانب خسائر أخرى [5]. عملياً، هذا يعني أن تسلسل الرابط (وضمنياً بنيته، كما يتنبأ بها AlphaFold2) يُحدَّث بشكل تكراري عبر الانحدار التدريجي بحيث تزداد درجة ipTM التي يمنحها AlphaFold2 للمركّب المتوقع رابط-هدف، إلى جانب حدود خسارة أخرى. هذه آلية مختلفة جوهرياً عن نموذج انتشار يأخذ عينة من هيكل أساسي ثم يصمم تسلسلاً له: هنا تعمل شبكة التنبؤ بالبنية نفسها كدالة الهدف التي يجري تحسينها.

لاختيار ipTM كهدف تحسين رئيسي ضعف معروف. لا تعكس ipTM بشكل مباشر الاحتمالية الإحصائية للتفاعل الكامل بين الرابط والهدف [5]. هذا مهم لأن هدف تصميم الروابط هو إيجاد تسلسلات من المرجح أن تطوى فعلياً إلى مركّب مستقر ومُلتحم بشكل صحيح، ودرجة لا تتتبع هذه الاحتمالية يمكن أن تدفع المُحسِّن نحو بنى تبدو واثقة وفق الدرجة لكنها ليست بالضرورة مركّبات مواتية فيزيائياً.

السبب الميكانيكي المحدد لهذا الضعف يكمن في كيفية حساب ipTM. نظراً لأن ipTM تحسب الحد الأقصى (maximum) عبر مؤشرات بقايا الهدف (residue indices)، فإنها تُنتج تدرجات متناثرة (sparse gradients) متركزة على مجموعة فرعية صغيرة فقط من أزواج بقايا الواجهة [5]. في التحسين القائم على التدرج، يعني التدرج المتناثر أن مواقع قليلة فقط في البنية تتلقى إشارة تحديث ذات معنى في كل خطوة، بينما لا تتشكل معظم الواجهة مباشرةً بواسطة الهدف. يمكن أن يؤدي هذا إلى تصاميم تُرضي الدرجة عند أزواج قليلة من البقايا دون أن تتشكل بقية الواجهة بشكل جيد، وهو سبب معقول للتصادمات البنيوية أو رداءة جودة المركّب الكلية في التصاميم المُولَّدة.

هذا التشخيص الميكانيكي، الموضَّح صراحةً في ورقة BindEnergyCraft، هو ما حفّز البحث عن دالة تقييم بديلة تمنح إشارة تدرج أكثر كثافة عبر الواجهة كاملةً بدلاً من إشارة متناثرة. أما بقية إطار التحسين، حلقة الهلوسة القائمة على AlphaFold2 والمفهوم العام للتحديثات القائمة على التدرج للبنية والتسلسل، فتبقى كما هي؛ فقط درجة الواجهة التي يجري تحسينها هي ما يحتاج إلى تغيير.

تُعيد pTMEnergy تفسير لوغاريتمات احتمالية خطأ المحاذاة المتوقع (pAE logits) من AlphaFold كنموذج قائم على الطاقة (energy-based model) على مركّبات الرابط-الهدف [5]. بدلاً من أخذ ملخص عددي واحد (كما تفعل ipTM، عبر عملية حد أقصى بين أزواج البقايا)، تعامل pTMEnergy التوزيع الكامل للوغاريتمات pAE على أنه يُعرّف مشهد طاقة، مانحةً درجة تستمد من حيث المبدأ معلومات من عبر الواجهة المتوقعة كاملةً وليس من مجموعة فرعية صغيرة منها فقط.

توفر pTMEnergy إشارة كثيفة قابلة للاشتقاق يُقصد بها أن تعكس احتمالية مركّب مطوي وفق التوزيع المتعلَّم من AlphaFold [5]. لأنها قابلة للاشتقاق، يمكن استبدالها مباشرةً في نفس حلقة التحسين القائمة على التدرج التي يستخدمها BindCraft بالفعل، دون الحاجة إلى نوع مختلف من المُحسِّنات. هذا يستهدف مباشرةً ضعف التدرج المتناثر الموصوف أعلاه: الإشارة الكثيفة تعني أن مزيداً من أزواج بقايا الواجهة تُسهم بتدرج ذي معنى في كل خطوة تحسين، على عكس حساب ipTM القائم على الحد الأقصى.

تفصيل تنفيذي رئيسي للمطوّر هو أن pTMEnergy مُشتقة من نفس مخرجات pAE المستخدمة في حساب ipTM ولا تتطلب استدعاءات نموذج إضافية أو تعديلات معمارية [5]. هذا يعني أن اعتماد pTMEnergy لا يتطلب إعادة تدريب AlphaFold2 أو إضافة مكونات شبكة جديدة: لوغاريتمات pAE التي يخرجها AlphaFold2 بالفعل تُعالَج ببساطة بشكل مختلف لإنتاج الدرجة الجديدة. هذه نقطة عملية مهمة لأنها تبقي التكلفة الحسابية لخط الأنابيب المعدَّل مماثلة تقريباً لتكلفة خط أنابيب BindCraft الأصلي، حيث لا حاجة لتمريرات أمامية أو خلفية إضافية عبر نموذج مختلف.

الطريقة الناتجة، BindEnergyCraft، والتي تحافظ على إطار تحسين BindCraft مع استبدال ipTM بـ pTMEnergy، حققت معدلات نجاح حاسوبية أعلى للروابط وتصادمات بنيوية أقل من BindCraft وRFDiffusion وESM3 عبر أهداف صعبة متعددة [5]. هذه مقارنة حاسوبية (in silico)، جرى تقييمها عبر الأهداف الصعبة المستخدمة في معيار تلك الورقة المرجعي؛ لا تُبلغ ادعاءات المصادر عن مقارنة مباشرة مخبرية بين BindEnergyCraft وBindCraft وRFDiffusion أو ESM3 على نفس المرشحين المُصنَّعين، لذا ينبغي للمطوّر قراءة التحسّن على أنه اكتشاف حاسوبي على مستوى المعيار المرجعي فقط، وليس ميزة تجريبية مؤكدة على هذه البدائل المحددة.

لأن درجات الثقة من نماذج التنبؤ بالبنية معروفة بأنها بدائل غير كاملة للارتباط الحقيقي، ولأن موثوقيتها موصوفة بشكل ضعيف عبر الأهداف، هناك حاجة إلى معيار مرجعي موحّد لمقارنة طرق ودوال تقييم تصميم الروابط. ProtDBench هو أحد هذه المعايير، صُمم خصيصاً لتقييم الهياكل الأساسية للروابط المُولَّدة بطريقة قابلة للتكرار ومتعددة المُحقّقين (verifiers).

يقيّم ProtDBench الهياكل الأساسية للروابط المُولَّدة عبر أخذ عينات من تسلسلات متعددة لكل هيكل أساسي، وتطبيق مُحقّق (verifier) ومرشّح (filter) على كل تسلسل، وحساب معدل النجاح لكل تسلسل [6]. يفصل هذا الإجراء بين مرحلتي تصميم غالباً ما تُخلط: خطوة توليد الهيكل الأساسي (التي تحدد الطية) وخطوة تصميم التسلسل (التي تحدد هوية الأحماض الأمينية الفعلية المُدرَجة على تلك الطية). عبر أخذ عينات من عدة تسلسلات لكل هيكل أساسي، يمكن للمعيار المرجعي التمييز بين الهياكل الأساسية السهلة لتصميم تسلسلات جيدة لها والهياكل الأساسية الناجحة أحياناً فقط.

يُعرّف ProtDBench مجموعة الهياكل الأساسية الناجحة (passing backbone set) بأنها الهياكل الأساسية التي يجتاز فيها تسلسل واحد على الأقل من التسلسلات المأخوذة كعينة المرشّح [6]. هذا معيار متساهل، أفضل-واحد-من-كثيرين، على مستوى الهيكل الأساسي: يُحسب الهيكل الأساسي نجاحاً إذا أنتج تسلسلاً واحداً جيداً على الأقل، حتى لو فشلت معظم التسلسلات المأخوذة كعينة له. يجمّع ProtDBench الهياكل الأساسية الناجحة فقط حسب التشابه البنيوي باستخدام FoldSeek أو TM-score [6]، مما يتيح للمعيار المرجعي الإبلاغ ليس فقط عن عدد نجاحات خام بل أيضاً عن مدى التنوع البنيوي للتصاميم الناجحة، متجنباً حالة أن تكون كل النجاحات المُبلَّغ عنها نسخاً شبه متطابقة من نفس الطية.

اكتشاف مركزي في هذا العمل المرجعي هو تحذير من الثقة المفرطة بأي مُحقّق منفرد. يُبلغ ProtDBench عن تحيّز كبير مرتبط بالمُحقّق واتفاق محدود بين نماذج التنبؤ بالبنية المستخدمة كمُحقّقين للتقييم [6]. هذا يعزز مباشرةً النقطة السابقة القائلة إن ipTM ومقاييس الثقة ذات الصلة لها ترابط مُختبَر مع الارتباط الحقيقي على مجموعات بيانات محدودة فقط [6]: إذا كانت نماذج التنبؤ بالبنية المختلفة المستخدمة كمُحقّقين تختلف بشكل كبير مع بعضها البعض، فلا يمكن افتراض أن معدل النجاح المحسوب بمُحقّق واحد (على سبيل المثال ipTM القائم على AlphaFold2) سيصمد عند استخدام مُحقّق مختلف بدلاً منه (على سبيل المثال AlphaFold3). بالنسبة للمطوّر، هذا يعني أن الإبلاغ عن نتائج من مُحقّق واحد دون الإفصاح عن المُحقّق المستخدم، أو دون التحقق المتقاطع مقابل مُحقّق ثانٍ، يخاطر بالمبالغة في الثقة بتصميم ما.

ليست جميع خطوط أنابيب تصميم الروابط قائمة على الهلوسة. سير عمل منفصل، قائم على البنية، يوضح كلا الوعد والصعوبة العملية للانتقال من تصميم حاسوبي إلى رابط مُتحقَّق منه. دمج سير عمل تصميم روابط موجّه بنقاط ساخنة (hotspot) بين RFdiffusion وProteinMPNN وAlphaFold ومحاكاة الديناميكا الجزيئية والتقييم البنيوي اليدوي [3]. يجمع سير العمل هذا بين خطوة انتشار للهيكل الأساسي (RFdiffusion)، وخطوة تصميم تسلسل (ProteinMPNN)، وفحص ثقة البنية (AlphaFold)، وخطوة محاكاة فيزيائية (الديناميكا الجزيئية)، ومراجعة بشرية، وهو خط أنابيب أثقل ويُشرَف عليه يدوياً بشكل أكبر من حلقة BindCraft الآلية أحادية الشبكة.

ولّد سير العمل الموجّه بنقاط ساخنة أربعة تصاميم بروتينية خضعت للتحقق التجريبي [3]. هذا عدد صغير من التصاميم مقارنةً بـ

تعتمد خطوط أنابيب تصميم الروابط بشكل متزايد على نماذج اللغة البروتينية (pLMs) كأداة تكميلية أو بديلة لتوليد التسلسل. تُدرَّب نماذج اللغة البروتينية (pLMs) مسبقاً على بيانات تسلسلات تطورية واسعة النطاق وتُكيّف نماذج اللغة الكبيرة للتسلسلات البيولوجية [17]. هذه آلية مختلفة عن الهلوسة القائمة على AlphaFold2 أو توليد الهيكل الأساسي القائم على RFdiffusion: يتعلم نموذج اللغة البروتيني الأنماط مباشرةً من قواعد بيانات تسلسلات واسعة وليس من بيانات تدريب بنيوية، ويُستخدم عادةً لاقتراح أو تقييم التسلسلات وليس الإحداثيات ثلاثية الأبعاد.

توجد عدة معماريات محددة ضمن هذه العائلة، وينبغي للمطوّر الذي يختار من بينها أن يعرف الاختلافات البنيوية بينها. ESM2 هو نموذج مُحوِّل ترميز (encoder transformer) على طراز BERT، بينما ProtGPT2 وProGen2 نموذجا مُحوِّل فك ترميز (decoder transformer) على طراز GPT، وProtT5 نموذج مُحوِّل ترميز-فك ترميز (encoder-decoder transformer) [17]. النموذج المُقتصر على الترميز مثل ESM2 يُستخدم عادةً لتقييم أو تضمين تسلسل موجود، والنموذج المُقتصر على فك الترميز مثل ProtGPT2 أو ProGen2 يُستخدم عادةً لتوليد تسلسلات جديدة بشكل ذاتي الانحدار، والنموذج ترميز-فك ترميز مثل ProtT5 يمكن استخدامه لمهام تُحوّل تمثيل تسلسل إلى آخر. لا يصف أي من الادعاءات المُستشهد بها إحلال نماذج اللغة البروتينية مباشرةً في حلقة تحسين BindCraft أو BindEnergyCraft، لذا ينبغي للمطوّر التعامل مع توليد التسلسل القائم على نماذج اللغة البروتينية على أنه أداة تكميلية منفصلة لاقتراح أو تصفية التسلسلات المرشحة، وليس بديلاً موثّقاً للاستخدام المباشر بدلاً من الهلوسة القائمة على AlphaFold2 في هذه الخطوط الأنابيب المحددة.

القيد المركزي لأي شخص يبني على هذا الأدب البحثي هو أن درجات الثقة ليست دليلاً على الارتباط. تم التحقق من ترابط مقاييس الثقة مثل pLDDT وipTM وipAE مع نتائج الارتباط التجريبية على مجموعات بيانات محدودة فقط ولا يزال مفهوماً بشكل ضعيف عبر الأهداف وأنظمة التصميم [6]. هذا يعني أن درجة ipTM أو pTMEnergy المرتفعة ينبغي أن تُقرأ كمرشح يزيد من فرصة إيجاد نتيجة إيجابية، وليس ضماناً، وأي معدل نجاح مُبلَّغ عنه مرتبط بفئة الهدف ومجموعة البيانات المحددة التي قِيس عليها.

تحمل ipTM نفسها ضعفاً ميكانيكياً معروفاً. لا تعكس ipTM بشكل مباشر الاحتمالية الإحصائية للتفاعل الكامل بين الرابط والهدف [5]، ولأنها تحسب الحد الأقصى عبر مؤشرات بقايا الهدف، فإنها تُنتج تدرجات متناثرة متركزة على مجموعة فرعية صغيرة فقط من أزواج بقايا الواجهة [5]. هذا سبب محدد وميكانيكي لتفضيل pTMEnergy كهدف تحسين عند إعادة إنتاج خطوط أنابيب على طراز BindCraft، رغم أن المقارنة بين BindEnergyCraft وBindCraft على أهداف مخبرية حقيقية لم يُبلَّغ عنها في الادعاءات المُستشهد بها، فقط المقارنة الحاسوبية عبر أهداف المعيار المرجعي [5].

تُعقّد اختيارات المعايير المرجعية والمُحقّقين المختلفة أيضاً أي مقارنة عبر الأوراق البحثية. يُبلغ ProtDBench عن تحيّز كبير مرتبط بالمُحقّق واتفاق محدود بين نماذج التنبؤ بالبنية المستخدمة كمُحقّقين للتقييم [6]، لذا لا يمكن مقارنة معدلات النجاح المحسوبة بمُحقّقين مختلفين، أو المُبلَّغ عنها من قِبل أوراق بحثية مختلفة تستخدم خطوط أنابيب مختلفة، مباشرةً دون معرفة أي مُحقّق استُخدم. وبالمثل، ليست النتائج على فئات أهداف محددة موحدة: نفس الطريقة العامة (BindCraft) نجحت بقوة في MDM2 وWDR5 [12] لكنها لم تُنتج أي روابط قابلة للكشف لـ PD-1 وPD-L1 [12]، وسير عمل منفصل موجّه بنقاط ساخنة يستخدم أدوات مختلفة تماماً (RFdiffusion وProteinMPNN وAlphaFold ومحاكاة الديناميكا الجزيئية [3]) نجح في تصميم واحد فقط من أصل أربعة تصاميم ضد نطاق LEDGF PWWP [3]، وهذا النجاح الوحيد معقّد بتكوّن ثنائي غير مرغوب فيه (homodimerization) [3]. لا ينبغي تعميم أي من هذه النتائج على أهداف أو ظروف لم تُختبَر مباشرةً.

أخيراً، يبقى تحديد المرشحين ذوي التقارب العالي عائقاً لأن تصميم الروابط يتطلب عادةً توليد وفرز آلاف التصاميم افتراضياً لاستخراج عدد قليل من النتائج الواعدة [5]. حتى مع دالة تقييم محسّنة مثل pTMEnergy، أو جهد توليد واسع النطاق مثل Human Bindome الذي يغطي 40.9% من البروتيوم البشري [13]، لم تُلغَ الحاجة الأساسية لتصفية مجموعة مرشحين كبيرة إلى عدد صغير من التصاميم القابلة للاختبار مخبرياً بواسطة أي من الأعمال المُستشهد بها، بل خُففت جزئياً فقط. ينبغي للمطوّر تخصيص ميزانية لخطوة التصفية هذه وألا يتوقع من أي درجة حاسوبية منفردة أن تُلغي الحاجة للتحقق التجريبي.

1. إعداد بيئة BindCraft الأساسية. ثبّت خط أنابيب BindCraft المفتوح المصدر والآلي لتصميم روابط بروتينية من الصفر [7]، والذي يستفيد من أوزان AlphaFold2 لتوليد روابط بروتينية انطلاقاً من بنى الأهداف [7]. ستحتاج إلى أوزان نموذج AlphaFold2 متاحة محلياً وحزمة استدلال JAX/AlphaFold2 عاملة، لأن خط الأنابيب يشغّل تحسيناً قائماً على التدرج داخل هذه الشبكة بدلاً من استدعاء واجهة برمجية خارجية.
2. تحضير مدخل بنية الهدف. احصل على ملف بنية PDB لبروتين الهدف الخاص بك. إذا كنت تخطط لإعادة إنتاج تصميم موجّه بنقاط ساخنة بدلاً من ذلك، لاحظ أن سير عمل منشور منفصل دمج بين RFdiffusion وProteinMPNN وAlphaFold ومحاكاة الديناميكا الجزيئية والتقييم البنيوي اليدوي [3] كبديل للهلوسة أحادية الشبكة؛ قرّر مسبقاً أي العائلتين تبنيها، لأنهما تحتاجان إلى حزم برمجية مختلفة.
3. اختيار هدف التحسين. خسارة BindCraft الافتراضية هي تحسين قائم على الهلوسة وعلى التدرج لدرجة TM المتوقعة للواجهة (ipTM)، إلى جانب خسائر أخرى [5]. إذا أردت المتغير المُحسَّن، استبدل ipTM بـ pTMEnergy، التي تُعيد تفسير لوغاريتمات خطأ المحاذاة المتوقع (pAE) من AlphaFold كنموذج قائم على الطاقة على مركّبات الرابط-الهدف [5] ولا تتطلب استدعاءات نموذج إضافية أو تعديلات معمارية [5]، لأنها مُشتقة من مخرجات pAE التي تحسبها بالفعل.
4. تشغيل حلقة التحسين. كرّر تحديثات التدرج على تسلسل/بنية الرابط لزيادة الدرجة المختارة (ipTM أو pTMEnergy) مقابل الهدف الثابت. ضع في اعتبارك أن ipTM تُنتج تدرجات متناثرة متركزة على مجموعة فرعية صغيرة فقط من أزواج بقايا الواجهة [5]، لذا إذا لاحظت تصادمات أو واجهات مُشكَّلة بشكل رديء خارج بضع بقايا تماس، فهذا نمط فشل معروف للتحسين القائم على ipTM، وpTMEnergy هو التخفيف الموثّق [5].
5. توليد مجموعة كبيرة من المرشحين. نظراً لأن تحديد المرشحين ذوي التقارب العالي يبقى عائقاً ويتطلب عادةً توليد وفرز آلاف التصاميم افتراضياً لاستخراج عدد قليل من النتائج الواعدة [5]، خطّط لميزانيتك الحسابية لدفعة من مرشحين كثيرين لكل هدف، وليس حفنة منها.
6. تقييم وتصفية المرشحين بنماذج التنبؤ بالبنية. تُمكّن نماذج التنبؤ بالبنية مثل AlphaFold2 وAlphaFold3 تقييم الارتباط دون بنى بلورية [5]، وتترابط درجات الثقة، وخاصةً ipTM، مع قوة الارتباط [5]. استخدم هذه الدرجات كمرشح أولي، لكن تذكّر أن هذا الترابط تم التحقق منه على مجموعات بيانات محدودة فقط [6].
7. وضع معيار مرجعي ببروتوكول متعدد المُحقّقين ولكل تسلسل. اتبع نهج ProtDBench: خذ عينة من تسلسلات متعددة لكل هيكل أساسي مُولَّد، وطبّق مُحقّقاً ومرشّحاً على كل تسلسل، واحسب معدل النجاح لكل تسلسل [6]. عرّف مجموعة الهياكل الأساسية الناجحة على أنها الهياكل الأساسية التي يجتاز فيها تسلسل واحد على الأقل المرشّح [6]، وجمّع الهياكل الأساسية الناجحة فقط حسب التشابه البنيوي باستخدام FoldSeek أو TM-score [6] للتحقق من تنوع التصاميم.
8. التحقق المتقاطع مع أكثر من مُحقّق واحد. نظراً لأن ProtDBench يُبلغ عن تحيّز كبير مرتبط بالمُحقّق واتفاق محدود بين نماذج التنبؤ بالبنية المستخدمة كمُحقّقين [6]، شغّل مرشّحك بنموذجَي تنبؤ بنيوي مختلفَين على الأقل وأبلغ عن كلتا النتيجتين بدلاً من الاعتماد على واحد فقط.
9. اختيار قائمة مختصرة للتصنيع. من مرشحيك المُصفَّاة والمُجمَّعة، اختر قائمة مختصرة متنوعة للاختبار المخبري. توقّع تبايناً يعتمد على الهدف: وجدت اختبارات مستقلة أن 7 من 15 ببتيداً مُصنَّعاً لـ MDM2 ارتبط بشكل نوعي [12]، و6 من 9 مرشحين لـ WDR5 ارتبطوا بتقارب دون-ميكرومولاري [12]، لكن لم يرتبط أي من الببتيدات المُختبَرة لـ PD-1/PD-L1 على الإطلاق [12]، لذا تعامل مع قائمتك المختصرة الحاسوبية كفرضية يجب اختبارها، وليس ضماناً.
10. التحقق التجريبي. استخدم فحص ارتباط فيزيائي حيوي (كما استُخدم للتأكد من تقارب منخفض-ميكرومولاري لرابط نطاق LEDGF PWWP [3]) وحيثما كان ملائماً، فحص منافسة لتأكيد الخصوصية بالموقع، كما جرى لببتيدات MDM2 [3][12]. راقب السلوك غير المتوقع مثل التكوّن الثنائي (homodimerization)، والذي تداخل في حالة واحدة مع الارتباط في المحلول رغم أن البروتين لا يزال قابلاً للتبلور المشترك مع هدفه بدقة 2.1 أنغستروم [3].
11. الإبلاغ عن النتائج بكامل الشروط. عند النشر أو تسجيل معدلات النجاح، اذكر دائماً أي مُحقّق، وأي معيار مرجعي، وأي فئة هدف أنتجت الرقم، نظراً لأن معدلات النجاح التي تتراوح من 10% إلى 100% [7] واكتشاف اختلاف المُحقّقين [6] تعني أن رقم معدل نجاح غير مشروط لا يقدم معلومة كافية بمفرده.

مخطط شبه-كود لحلقة الهلوسة الأساسية مع خيار pTMEnergy:

load target_structure from PDB file
initialize binder_sequence randomly
for step in range(num_steps):
    complex_pred = alphafold2_forward(binder_sequence, target_structure)
    if objective == "ipTM":
        loss = -complex_pred.ipTM
    elif objective == "pTMEnergy":
        loss = -pTMEnergy(complex_pred.pae_logits)
    grads = backprop(loss, wrt=binder_sequence)
    binder_sequence = update(binder_sequence, grads)
return binder_sequence, complex_pred.ipTM, complex_pred.pTMEnergy

ينفّذ البرنامج النصي أدناه، على بياناتنا الخاصة بـ SQLite، نسخة مبسّطة من فكرتَي التقييم المركزيتين لهذه المذكرة: (1) حساب على طراز ProtDBench لمعدل النجاح لكل تسلسل ومجموعة الهياكل الأساسية الناجحة عبر المرشحين المُولَّدين (الادعاءان R وS)، باستخدام تجميع تشابه بنيوي للتصاميم الناجحة عبر بديل شبيه بـ TM-score (الادعاء T)، و(2) مقارنة بين دالتَي تقييم مماثلتين لـ ipTM مقابل pTMEnergy (الادعاءات B وI وJ وM وN وO وP)، محسوبة من أعمدة جدول `forecasts` الخاص بنا (q10 وq50 وq90 وp_up) التي تحل محل درجات على طراز الثقة، لأن بياناتنا لا تحتوي على لوغاريتمات pAE حقيقية من AlphaFold أو قيم ipTM. نظراً لأن مخططنا لا يحتوي على جداول تصميم روابط، نعامل كل صف من `forecasts` كتصميم مرشح واحد لرمز/هدف واحد، ونعامل `p_up` كدرجة ثقة متناثرة على طراز ipTM، ومزيجاً كثيفاً من انتشار q10/q50/q90 كدرجة كثيفة على طراز pTMEnergy (هذا الاستبدال موضَّح بوضوح في التعليقات البرمجية؛ إنه توضيح لمنهج مقارنة الدرجات، وليس ادعاءً بأن بيانات السوق لدينا هي بيانات بروتين). المعيار الأساسي الذي يجب التفوق عليه هو معدل نجاح المرشّح البسيط على طراز ipTM؛ ومن المتوقع أن تمنح الدرجة الكثيفة على طراز pTMEnergy ترتيباً أكثر استقراراً وأقل تناثراً، وهو ما نتحقق منه بمقارنة عدد الميزات البديلة لزوج البقايا (q10 وq50 وq90) التي تتباين فعلياً مقابل مقدار تغيّر الدرجة الناتج عن ميزة واحدة فقط (فحص بديل التدرج المتناثر مقابل الكثيف، الادعاء J). يبني البرنامج النصي أيضاً تقريراً صغيراً على طراز ProtDBench: معدل النجاح لكل مرشح، وحجم مجموعة الهياكل الأساسية الناجحة، وتجميع بسيط بتقريب الدرجات (بديل لتجميع FoldSeek/TM-score، الادعاء T). يطبع أرقامه ويقارنها بمعدل نجاح خط أساس عشوائي. يعمل كل شيء دون اتصال بالإنترنت مقابل `data.sqlite` (أو QOURAT_DB)، وينتهي في أقل بكثير من ثلاث دقائق على وحدة المعالجة المركزية (CPU)، ولا يُثير أي استثناءات إذا كانت الجداول موجودة (وينشئ مجموعة بيانات اصطناعية صغيرة إذا لم يحتوِ الملف على بيانات، لذا فهو قابل للتشغيل بشكل مستقل أيضاً).

import os
import sqlite3
import sys
import time
import numpy as np
import pandas as pd

# ---------------------------------------------------------------------------
# Config
# ---------------------------------------------------------------------------
DB_PATH = os.environ.get("QOURAT_DB", "data.sqlite")
RNG = np.random.default_rng(0)


def get_connection(path):
    # Opens (or creates) the sqlite file. No network access needed.
    conn = sqlite3.connect(path)
    return conn


def ensure_tables(conn):
    # Creates the required tables if they do not exist yet, so the script
    # is runnable even against a fresh empty file. Schema matches the spec.
    cur = conn.cursor()
    cur.execute("""CREATE TABLE IF NOT EXISTS bars (
        symbol TEXT, tf TEXT, ts TEXT, open REAL, high REAL, low REAL,
        close REAL, volume REAL)""")
    cur.execute("""CREATE TABLE IF NOT EXISTS forecasts (
        symbol TEXT, horizon TEXT, made_at TEXT, q10 REAL, q50 REAL,
        q90 REAL, p_up REAL)""")
    cur.execute("""CREATE TABLE IF NOT EXISTS trades (
        symbol TEXT, ts TEXT, price REAL, size REAL, side TEXT)""")
    cur.execute("""CREATE TABLE IF NOT EXISTS book (
        symbol TEXT, ts TEXT, level INTEGER, bid_price REAL,
        bid_size REAL, ask_price REAL, ask_size REAL)""")
    conn.commit()


def maybe_seed_forecasts(conn):
    # If the forecasts table is empty, populate it with a small synthetic
    # set of "candidate designs" so the pipeline below has something to
    # score. This stands in for generated binder candidates: each row is
    # one candidate for one "target" (symbol), analogous to one sampled
    # sequence for one backbone in ProtDBench (claim R).
    df = pd.read_sql_query("SELECT COUNT(*) AS n FROM forecasts", conn)
    if df["n"].iloc[0] > 0:
        return
    symbols = ["AAPL", "MSFT", "BTC-USD"]
    rows = []
    for sym in symbols:
        for i in range(60):
            q50 = RNG.normal(0, 1)
            spread = abs(RNG.normal(0.5, 0.2)) + 0.01
            q10 = q50 - spread
            q90 = q50 + spread
            p_up = float(np.clip(RNG.normal(0.5, 0.2), 0, 1))
            rows.append((sym, "1d", f"2024-01-{(i % 28) + 1:02d}T00:00:00",
                         q10, q50, q90, p_up))
    conn.executemany(
        "INSERT INTO forecasts (symbol, horizon, made_at, q10, q50, q90, p_up) "
        "VALUES (?,?,?,?,?,?,?)", rows)
    conn.commit()


# ---------------------------------------------------------------------------
# Scoring functions
# ---------------------------------------------------------------------------

def sparse_score(row):
    # Proxy for ipTM-style scoring: BindCraft optimizes ipTM, a score that
    # computes a max over target residue indices and gives sparse
    # gradients concentrated on a small subset of interface pairs
    # (claims B and J). Here we proxy this by taking the single most
    # extreme of the three quantile-derived features, i.e. a max-like
    # operation over a small set of "residue pair" proxies (q10, q50, q90).
    feats = np.array([abs(row["q10"]), abs(row["q50"]), abs(row["p_up"] - 0.5)])
    return float(feats.max())


def dense_score(row):
    # Proxy for pTMEnergy-style scoring: pTMEnergy is derived from the same
    # underlying outputs (here: q10, q50, q90, p_up) but combines them into
    # a dense signal rather than taking a single max (claims M, N, O).
    # We use a simple mean of the same features, so every feature
    # contributes to the score, not just the largest one.
    feats = np.array([abs(row["q10"]), abs(row["q50"]), abs(row["q90"]),
                       abs(row["p_up"] - 0.5)])
    return float(feats.mean())


def gradient_sparsity(row):
    # Checks how much of the sparse score is driven by a single feature
    # versus spread across features, as a numeric illustration of claim J
    # (sparse gradients concentrated on a small subset of interface pairs).
    # Returns the fraction of total feature magnitude held by the largest
    # single feature: close to 1.0 means very sparse, close to 1/n means
    # evenly dense.
    feats = np.array([abs(row["q10"]), abs(row["q50"]), abs(row["q90"]),
                       abs(row["p_up"] - 0.5)])
    total = feats.sum()
    if total = threshold
    per_seq_success_rate = float(df["passes"].mean())

    backbone_groups = df.groupby("symbol")
    passing_backbones = []
    for symbol, group in backbone_groups:
        if group["passes"].any():
            passing_backbones.append(symbol)
    passing_backbone_set = set(passing_backbones)

    return per_seq_success_rate, passing_backbone_set, df


def cluster_passing_backbones(df, passing_backbone_set):
    # Proxy for claim T: ProtDBench clusters only passing backbones by
    # structural similarity using FoldSeek or TM-score. We do not have
    # real structures, so we use a simple proxy: cluster passing backbones
    # by rounding their mean score to one decimal place, as a stand-in
    # for a structural-similarity bucket.
    passing_df = df[df["symbol"].isin(passing_backbone_set)]
    if len(passing_df) == 0:
        return {}
    means = passing_df.groupby("symbol")["score"].mean()
    clusters = {}
    for symbol, m in means.items():
        key = round(m, 1)
        clusters.setdefault(key, []).append(symbol)
    return clusters


# ---------------------------------------------------------------------------
# Baseline: random scoring, to check the two methods beat pure chance
# ---------------------------------------------------------------------------

def random_baseline_success_rate(n_rows, threshold, n_trials=200):
    # A simple baseline: if scores were pure random noise in [0, 1.5],
    # what fraction would pass the threshold? This is the number to beat.
    rates = []
    for _ in range(n_trials):
        fake_scores = RNG.uniform(0, 1.5, size=n_rows)
        rates.append(float((fake_scores >= threshold).mean()))
    return float(np.mean(rates))


def main():
    start = time.time()
    conn = get_connection(DB_PATH)
    ensure_tables(conn)
    maybe_seed_forecasts(conn)

    df = pd.read_sql_query(
        "SELECT symbol, horizon, made_at, q10, q50, q90, p_up FROM forecasts",
        conn)
    conn.close()

    if len(df) == 0:
        print("No forecast rows found even after seeding, aborting.")
        sys.exit(1)

    threshold = 0.5  # fixed filter threshold for both scoring functions

    sparse_rate, sparse_passing, sparse_df = protdbench_style_eval(
        df, sparse_score, threshold)
    dense_rate, dense_passing, dense_df = protdbench_style_eval(
        df, dense_score, threshold)

    sparsity_values = df.apply(gradient_sparsity, axis=1)
    mean_sparsity = float(sparsity_values.mean())

    sparse_clusters = cluster_passing_backbones(sparse_df, sparse_passing)
    dense_clusters = cluster_passing_backbones(dense_df, dense_passing)

    baseline_rate = random_baseline_success_rate(len(df), threshold)

    print("=== BindCraft-style scoring comparison (proxy data) ===")
    print(f"Rows (candidate designs) evaluated: {len(df)}")
    print(f"Backbones (symbols) evaluated: {df['symbol'].nunique()}")
    print()
    print("-- ipTM-style (sparse, max-based) scoring --")
    print(f"Per-sequence success rate: {sparse_rate:.3f}")
    print(f"Passing backbone set size: {len(sparse_passing)} "
          f"of {df['symbol'].nunique()}")
    print(f"Structural-similarity clusters (proxy): {sparse_clusters}")
    print()
    print("-- pTMEnergy-style (dense, mean-based) scoring --")
    print(f"Per-sequence success rate: {dense_rate:.3f}")
    print(f"Passing backbone set size: {len(dense_passing)} "
          f"of {df['symbol'].nunique()}")
    print(f"Structural-similarity clusters (proxy): {dense_clusters}")
    print()
    print(f"Mean gradient sparsity of ipTM-style score (1.0 = fully "
          f"sparse, 0.25 = fully dense over 4 features): {mean_sparsity:.3f}")
    print()
    print(f"Random baseline success rate to beat: {baseline_rate:.3f}")
    print()
    if dense_rate >= sparse_rate and dense_rate > baseline_rate:
        print("RESULT: dense (pTMEnergy-style) scoring matched or beat "
              "sparse (ipTM-style) scoring, and both beat the random baseline.")
    else:
        print("RESULT: dense scoring did not clearly beat sparse scoring "
              "on this data; inspect thresholds and feature scaling.")

    elapsed = time.time() - start
    print(f"\nElapsed time: {elapsed:.2f} seconds")


if __name__ == "__main__":
    main()